Cu及銅合金因其具有優(yōu)異的耐蝕性、可加工性、導(dǎo)熱性和電導(dǎo)率低等特點，在海洋工程設(shè)施中廣泛應(yīng)用[1,2]。在海洋環(huán)境中大多數(shù)合金遭受由海洋細菌引起的微生物腐蝕 （MIC），目前有大量關(guān)于好氧菌對銅合金微生物腐蝕行為的報道[2,3,4,5,6]，研究表明樣品表面細菌生物膜的附著會影響Cu及其合金的腐蝕。

海洋環(huán)境中，船舶等海洋工程設(shè)施在移動過程中產(chǎn)生電磁場，影響細菌的生理活動[7,8]和金屬材料腐蝕[9,10,11]。磁場通過改變?nèi)芤旱膒H值[12]，抑制傳質(zhì)過程[13,14]等方式影響材料的腐蝕。目前研究[15]表明，磁場可以抑制Cu的腐蝕速率，通過延遲表面Cu2O的形成及促進CuCl2-的擴散來影響Cu的腐蝕。另外磁場也會影響微生物的生理活動[16]。一些研究[8]表明，隨著時間、溫度和磁場強度的增大，細菌的數(shù)量及其生存力下降。磁場還會影響細菌生物膜的形成，殺死部分微生物，減緩細菌生長。近年來，研究者們對磁場抑制或去除細菌生物膜的形成很感興趣，有研究[17]表明低磁場強度 （2~4 mT） 通過控制硫酸鹽還原菌 （SRB） 活性降低了304不銹鋼的MIC，延遲金屬表面上生物膜的形成。磁場抑制鐵氧化細菌 （IOB） 的生長且在碳鋼表面生成更致密的生物礦化膜[18]。MIC是不同微生物之間相互協(xié)同作用的結(jié)果，然而實際環(huán)境中并不是單一的細菌，細菌群落之間通過群體感應(yīng)相互作用，這種相互作用在生物膜中尤為明顯，會使生物膜的官能團改變，影響細菌分布及產(chǎn)生的生物總量[19]。近年來人們逐漸開始研究多細菌生物膜的作用[20]。目前有研究顯示，與鑄鐵在單個細菌溶液中相比，銅綠假單胞菌和SRB兩種細菌共同存在時鑄鐵的腐蝕速率有所變化，細菌在樣品表面吸附的生物膜含量也有所不同[21]。因此，研究混合細菌對材料的腐蝕是很有必要的。雖然已有大量關(guān)于磁場對腐蝕行為影響的報道，但是關(guān)于在非順磁性離子溶液中非鐵磁電極的磁場效應(yīng)的研究很少，目前沒有關(guān)于磁場和混合好氧細菌對純Cu腐蝕影響的報道。由于其在海洋環(huán)境中的大量應(yīng)用，有必要對其進行研究。

本研究探討了磁場與混合海洋細菌共同存在的條件下純Cu的腐蝕規(guī)律，通過電化學(xué)方法和表面分析技術(shù)研究了磁場對于銅微生物腐蝕的影響，為其在工業(yè)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料是10 mm×10 mm×5 mm的純Cu。樣品通過240，400，800，1500和2000#的砂紙依次打磨并拋光，隨后在無水乙醇中超聲清洗5 min清除表面雜質(zhì)及污染物，用N2吹干備用。實驗前將樣品置于紫外燈下滅菌30 min。

從舟山海域采集并分離出4種海洋細菌，通過中國海洋微生物菌種保藏管理中心鑒定，分別為弧菌 （Vibrio sp.），威尼斯不動桿菌 （Acinetobacter venetianus），河流弧菌 （Vibrio fluvialis），咸海鮮芽孢桿菌 （Jeotgalibacillus sp.）。細菌在模擬海水中進行富集培養(yǎng)，模擬海水的具體成分為：23.476 g/L NaCl，10.61 g/L MgCl2·6H2O，0.780 g/L CaCl2·6H2O，0.192 g/L NaHCO3，3.917 g/L Na2SO4，0.667 g/L KCl，0.096 g/L KBr，0.026 g/L硼酸，其余為蒸餾水，另外加入3 g/L的魚粉蛋白胨作為碳氮營養(yǎng)源[22]。用3 mol/L NaOH溶液緩慢調(diào)節(jié)細菌培養(yǎng)基的pH值至7.7±0.2。隨后放入高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌 （加熱至121 ℃保溫20 min），取出冷卻至室溫待用。

實驗采用的是相互平行的Nd-Fe-B磁鐵 （異名磁極相對） 作為靜磁場裝置，放置于試樣兩側(cè)，保證試樣處于磁場中心，磁場方向與試樣表面垂直。由Tesla meter測量磁場強度，實驗中所用的磁場強度分別為28和60 mT。

1.2 測試方法

實驗采用比濁法測定細菌的生長曲線，利用SpectraMax 190光吸收型酶標儀測定細菌的吸光度 （OD值） 來推知菌液濃度，測量有、無磁場條件下經(jīng)稀釋100倍的混合細菌在模擬海水培養(yǎng)液中生長7 d的OD值，將所測得的OD值與對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖即可繪制出混合細菌的生長曲線。實驗中選用的波長是600 nm。

純Cu樣品浸入有/無磁場的含菌海水中10 d后，用超凈水清洗，放入戊二醛消毒液中浸泡2 h后，分別用50%，75%和100% （體積分數(shù)） 乙醇溶液進行梯度洗脫，N2吹干，在場發(fā)射掃描電鏡 （FE-SEM，F(xiàn)EIQuanta FEG 250） 下觀察樣品表面形貌。然后在磷酸緩沖鹽溶液 （PBS） 中超聲10 min，去除掉表面的生物膜，觀察去除生物膜后的表面形貌。Cu表面的腐蝕產(chǎn)物通過Axis Ultra DLD 型X射線光電子能譜儀 （XPS） 進行分析。

利用激光共聚焦顯微鏡 （CLSM，LeiCa TCS SP5） 觀察純Cu表面細菌的吸附情況。將試樣取出后，用3 μL/L 熒光染色劑SYT09 對Cu表面進行染色處理，避光靜置20 min，用超凈水將表面的染色劑沖洗掉，N2吹干后用CLSM觀察。

將10 mm×10 mm×5 mm的塊狀樣品，以10 mm×10 mm作為工作面，非工作面用環(huán)氧樹脂封涂，背面用Cu導(dǎo)線點焊導(dǎo)出，用于電化學(xué)測試。電化學(xué)實驗儀器為PGSTAT302 Autolab電化學(xué)工作站。采用標準的三電極體系：工作電極為純Cu，參比電極為飽和甘汞電極 （SCE），輔助電極為Pt電極。測量有/無磁場條件下浸泡1，3，5，7和10 d后樣品的電化學(xué)阻抗譜 （EIS），EIS在自腐蝕電位下測試，激勵信號為10 mV的正弦波，測試頻率范圍為105~10-2 Hz。極化測試掃描范圍為相對于開路電位±250 mV，掃描速率為0.2 mV/s。

純Cu樣品浸入有/無磁場的含菌溶液中10 d后，用Fourier變換紅外光譜儀 （FTIR，Agilent Cary660） 來分析樣品表面吸附的生物膜內(nèi)特征官能團[23]。紅外光譜掃描范圍為4000~500 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為2 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁場對細菌生長情況的影響

圖1為細菌在有/無磁場條件下的生長情況。由于采用的是半連續(xù)培養(yǎng)，所以其生長曲線沒有典型的對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期等特征。如圖所示，不同磁場對細菌生長的影響不同。無磁場條件下培養(yǎng)20 h后細菌的生長速度達到最大值，之后保持穩(wěn)定；28 mT下培養(yǎng)24 h后達到最大值，之后保持穩(wěn)定，且細菌數(shù)量少于無磁場條件；而60 mT下培養(yǎng)40 h后細菌數(shù)量達到最大值且數(shù)量多于無磁場條件下的，之后變得穩(wěn)定。

圖1   有/無磁場條件下細菌的生長曲線

2.2 磁場條件下純Cu表面微生物腐蝕形貌分析

樣品浸泡在含菌溶液中時，細菌會逐漸吸附在樣品表面并分泌胞外分泌物 （EPS），這些分泌物將細菌牢牢吸附在樣品表面，形成了微生物從可逆吸附向不可逆吸附的轉(zhuǎn)變，生物膜從游離態(tài)向固著態(tài)轉(zhuǎn)變，生成特殊的次級代謝產(chǎn)物[24]。圖2為純Cu在不同磁場條件下浸泡不同時間后表面形貌的SEM像?？梢钥闯?，純Cu表面由細菌分泌的代謝產(chǎn)物形成的生物膜和Cu的氧化膜組成，隨著時間的延長，樣品表面的生物膜會發(fā)生剝落；施加磁場后，樣品表面生物膜形成和剝落的速度加快，且60 mT比28 mT磁場條件下生物膜形成與剝落的速度更快。

圖2   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中分別浸泡不同時間后的SEM 像

去除掉樣品表面的腐蝕產(chǎn)物后 （圖3），兩種條件下樣品表面都發(fā)生了點蝕，28 mT磁場條件下無明顯變化，而60 mT磁場條件下純Cu表面更為致密。用CLSM觀察點蝕坑的形貌和深度，浸泡10 d后Cu表面有很多點蝕坑，在無磁場條件下點蝕坑的平均深度為4.59 μm，28 mT磁場條件下點蝕坑平均深度為3.47 μm，60 mT磁場條件下點蝕坑平均深度為2.47 μm。這些數(shù)據(jù)表明，磁場能抑制Cu的腐蝕，磁場強度為60 mT時比28 mT時抑制效果更明顯。

圖3   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中浸泡10 d后去除表面腐蝕產(chǎn)物后的SEM像

2.3 磁場對生物膜結(jié)構(gòu)的影響

圖4顯示了Cu在有/無磁場的含菌溶液中浸泡不同時間后的CLSM圖。無磁場條件下，Cu在溶液中浸泡1 d后大量細菌附著在表面上 （圖4a）；7 d后Cu表面形成均勻的生物膜 （圖4d），但大多數(shù)細菌已經(jīng)死亡；在10 d后可以清楚地觀察到生物膜持續(xù)生長，此時受損細胞的數(shù)量顯著增加并且生物膜變得不均勻 （圖4g）。28 mT磁場下，浸泡1 d后Cu表面附著的細菌數(shù)量減少，覆蓋有一層均勻的生物膜；7 d后生物膜變得疏松；10 d后樣品表面又形成更加均勻的生物膜。60 mT條件下，浸泡1 d后Cu表面形成致密均勻的生物膜；7 d后表面生物膜疏松；浸泡10 d后生成均勻的生物膜。明顯可見，磁場可以加快生物膜形成與剝落的速度，且磁場強度為60 mT時銅表面生物膜的附著速率比28 mT條件下的更快，更易形成生物膜。

圖4   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中浸泡不同時間后的CLSM圖

生物膜內(nèi)包含多種物質(zhì)，如EPS中的多聚糖、蛋白質(zhì)以及核酸等，測定這些物質(zhì)在生物膜中的含量和分布是深入了解微生物腐蝕機理的重要步驟，可使用FTIR來分析生物膜的成分。圖5為純Cu在有/無磁場條件下浸泡10 d后表面生物膜的FTIR譜?？梢钥闯?，有磁場時官能團對應(yīng)的峰值強度顯著降低。浸泡10 d后，有/無磁場條件下均在3200 cm-1附近 （3700~3300 cm-1為羥基和氨基的疊加吸收區(qū)） 有水分子和蛋白質(zhì)的O—H和N—H的伸縮振動吸收峰[25]；2929和2962 cm-1附近對應(yīng)的是CH2和CH3的伸縮振動峰，表明生物膜結(jié)構(gòu)中存在脂肪酸[26]，60 mT磁場條件下該峰消失。在1652 cm-1附近對應(yīng)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動吸收峰，且有磁場時該峰的強度顯著降低，表明磁場條件下該物質(zhì)含量減少。在1552 cm-1附近對應(yīng)蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的N—H的彎曲振動/C—N的伸縮振動，酰胺Ⅰ和Ⅱ帶特征吸收峰的出現(xiàn)說明有/無磁場條件下樣品表面均有蛋白質(zhì)生成。1324 cm-1附近對應(yīng)的是—O—H鍵的伸縮振動峰，施加磁場時該峰消失。1249 cm-1附近對應(yīng)蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶C=N的伸縮振動吸收峰，60 mT磁場條件下該峰消失。在1118和1124 cm-1附近對應(yīng)的是C—O的收縮振動峰，表明有多糖類物質(zhì)存在[27]。在845和855 cm-1附近對應(yīng)的是α型糖苷鍵的指紋吸收峰[25]。

圖5   Cu在未施加磁場與施加磁場的溶液中浸泡10 d后表面生物膜的FTIR譜

FTIR結(jié)果表明，生物膜結(jié)構(gòu)由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物組成，但隨著磁場的增大，脂質(zhì)含量減少。相比無磁場條件，磁場強度為28 mT時蛋白質(zhì)含量降低，碳水化合物含量增多。60 mT條件下生物膜結(jié)構(gòu)有所變化，主要由蛋白質(zhì)和碳水化合物組成，且相比于無磁場條件蛋白質(zhì)含量降低，碳水化合物含量增多。磁場對生物膜結(jié)構(gòu)的這些影響可能導(dǎo)致樣品表面生物膜的性質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致Cu在有/無磁場溶液中的耐腐蝕性能產(chǎn)生差異。

2.4 磁場對Cu表面腐蝕產(chǎn)物的影響

為了更好地理解磁場對Cu微生物腐蝕的影響，用XPS對不同條件下Cu的腐蝕產(chǎn)物進行分析。圖6為腐蝕產(chǎn)物中的Cu 2p，C 1s，O 1s和N 1s元素的XPS結(jié)果。表1是各元素的峰值結(jié)合能及其對應(yīng)成分的具體參數(shù)。結(jié)果表明，靜磁場可以改變銅腐蝕產(chǎn)物的成分。無磁場時，結(jié)合能為531.3和530.2 eV O1s峰分別對應(yīng)的是C—O鍵和Cu2O[28,29]；28 mT條件下，結(jié)合能為530.5和529.1 eV的O1s峰分別對應(yīng)的是Cu2O和CuO；而60 mT磁場中，結(jié)合能為532.0和533.2 eV的O1s峰分別對應(yīng)的是有機官能團C=O和C—O。C 1s用來分析樣品表面存在的有機化合物，無磁場時，結(jié)合能為283.9，285.4和287.7 eV的C1s峰分別對應(yīng)的是C=C鍵，C=N鍵和C=O/CO2[30,31]；28 mT條件下，結(jié)合能為282.2，283.7，285.6 eV的C1s峰分別對應(yīng)的是C—O，C=C和C—N鍵。60 mT條件下，結(jié)合能為285.0，285.8和288.3 eV的C1s峰分別對應(yīng)的是C—C，C=N鍵和C—O鍵。無磁場條件下N1s的兩處峰值399.1和400.3 eV對應(yīng)的是=N—和C—NH2兩種官能團[32]，28 mT條件下，398.0和399.2 eV峰值對應(yīng)的是=N—和酰胺中的C—N—C鍵[27]，60 mT條件下401.3 eV峰值對應(yīng)的是N雜環(huán)與銅配位形成的N=Cu。對于Cu，樣品表面主要是CuO和Cu2O[15,33,34,35]。

圖6   有/無磁場條件下含菌溶液中浸泡10 d 后銅表面腐蝕產(chǎn)物的XPS分析

表1   純Cu在有/無磁場條件下的溶液中浸泡10 d后表面腐蝕產(chǎn)物的C、O、N和Cu的XPS光譜的擬合參數(shù)

C1s，N1s和O1s峰值強度和面積變化起因于Cu表面生物膜成分與厚度的變化。從表1中可看出，有/無磁場條件下各元素含量發(fā)生變化，施加磁場后O和Cu含量增大，且含量隨著磁場強度增大而增大。施加磁場，溶液溶解氧能力提高，加速Cu的氧化[36]，在樣品表面形成均勻致密的氧化膜，同時阻止海水中Cl-侵蝕，抑制Cu的腐蝕。有/無磁場條件下，O，C，N峰值處的結(jié)合能對應(yīng)的官能團有所不同，進一步表明磁場影響樣品表面生物膜的成分，這與FTIR結(jié)果一致。

2.5 微生物環(huán)境下磁場對純Cu電化學(xué)腐蝕行為的影響

2.5.1 極化曲線

圖7為純Cu樣品在不同磁場強度的溶液中浸泡10 d后的動電位極化曲線，利用Tafel直線外推法得到的電化學(xué)參數(shù)見表2。從圖7和表2可以看出，Cu在有/無磁場的溶液中浸泡10 d后，磁場作用下的樣品腐蝕速率降低，自腐蝕電位Ecorr負移，腐蝕電流密度Icorr從無磁場時的1.74 μA/cm-2下降到28 mT時的0.637 μA/cm-2，60 mT的腐蝕電流密度為0.559 μA/cm-2，達到了最低值。這一變化趨勢與阻抗圖顯示的一致，純Cu耐蝕性增強主要與表面覆蓋的生物膜及氧化膜有關(guān)[37]。

圖7   不同磁場條件下Cu在含菌溶液中浸泡10 d后的極化曲線

表2   Cu在未施加磁場和施加磁場的溶液中浸泡10 d后的極化參數(shù)

2.5.2 電化學(xué)阻抗譜

圖8為純Cu樣品在有/無磁場的溶液中浸泡不同時間后的Nyquist圖和Bode圖?？梢钥闯?，在有/無磁場條件中容抗弧半徑隨著浸泡時間延長先增大后減少，在3 d達到了最大值；浸泡0~3 d后，容抗弧半徑逐漸增大，說明電極表面的吸附平衡偏向吸附[38]，這段時間內(nèi)生物膜逐漸形成起到了保護作用；隨著浸泡時間的延長，容抗弧半徑逐漸減少，表明膜層發(fā)生局部破裂。圖9是對阻抗曲線進行擬合后的等效電路圖[39,40]，其中圖9a代表純Cu在無磁場條件下EIS對應(yīng)的等效電路，圖9b代表純Cu在磁場條件下EIS對應(yīng)的等效電路，表3列出了通過擬合得到的電化學(xué)參數(shù)。其中，Rs代表溶液介質(zhì)電阻，Rct為電荷轉(zhuǎn)移電阻，Rb代表微生物膜電阻，Rf代表樣品表面腐蝕氧化產(chǎn)物電阻，Rp代表樣品表面腐蝕產(chǎn)物膜電阻和細菌生物膜電阻。由于樣品的不均勻性，在等效電路中用常相位角元件 （CPE） 來代替電容，它的阻抗為：

圖8   Cu浸泡在不同磁場強度的含菌溶液中的Nyquist圖和Bode圖

圖9   Cu在有/無磁場條件下的溶液中浸泡10 d后EIS擬合所用等效電路

表3   Cu在未施加磁場和施加磁場的溶液中浸泡不同時間后的電化學(xué)阻抗譜擬合參數(shù)

CPEdl表示雙電層電容，CPEp代表氧化產(chǎn)物和微生物膜電容，CPEf為樣品表面腐蝕氧化產(chǎn)物電容，CPEb為微生物膜電容。

表3的電化學(xué)參數(shù)中，腐蝕初期 （0~3 d），Rct值先增大而后減緩，進一步表明試樣表面形成了完整的生物膜而后生物膜剝落，這與CLSM結(jié)果一致。從圖8和表3中可以看出，存在磁場條件下的容抗弧半徑大于無磁場條件下的容抗弧半徑，施加磁場后0~3 d Rct值增大，Cu表面腐蝕產(chǎn)物增多，表明磁場通過抑制質(zhì)量轉(zhuǎn)移過程影響Cu的腐蝕。之后，Rct值減小，主要是由于溶液中Cl-擴散加速傳質(zhì)過程。從圖8d~f中也可以看出，有/無磁場條件下最大相位角都隨著Cu在溶液中浸泡時間的延長而增大，表明隨著浸泡時間延長表面氧化層厚度增大，同時表明氧化層不是抑制Cu腐蝕過程的主要原因。結(jié)合阻抗譜和等效電路可以看出，無磁場條件下，存在兩個時間常數(shù)，純Cu表面的生物膜和氧化膜共同作用來影響純Cu的腐蝕；磁場條件下存在3個時間常數(shù)，磁場作用下樣品表面生物膜形成和剝落的速度加快，在此過程中生物膜會單獨影響Cu的腐蝕行為。從Bode圖中可看出，與無磁場相比，施加28 mT磁場條件下相位角幅度變大，樣品表面的腐蝕產(chǎn)物層增厚，有一定的物理阻隔效應(yīng)，且相位角峰值向低頻區(qū)移動，峰值增大，樣品表面生成較為完整的生物膜，對樣品起保護作用，腐蝕速率降低。施加60 mT磁場條件下，相位角峰值向低頻區(qū)移動，高頻區(qū)相位角的峰值增大，樣品表面形成由腐蝕產(chǎn)物和生物膜組成的較完整的膜層，對樣品起保護作用，腐蝕速率降低。且磁場強度為60 mT時比28 mT時對Cu腐蝕的抑制效果更明顯。

磁場通過抑制質(zhì)量轉(zhuǎn)移過程來抑制Cu的腐蝕，Cu在海水中主要遭受溶解氧和Cl-的侵蝕，反應(yīng)如下所示：

施加磁場會抑制上述反應(yīng)，降低Cu的腐蝕速率。且有文獻報道施加磁場后溶液中溶解氧能力增大，O2含量增多，加速Cu表面氧化[41]。此時，Cu在海水中的反應(yīng)為：

樣品表面生成更多的Cu2O，這與上述XPS分析的結(jié)果一致。施加磁場影響表面生物膜的結(jié)構(gòu)與成分，加速生物膜的形成與剝落，磁場作用下樣品表面形成更加均勻致密的生物膜，減少了溶解氧與Cu表面之間的相互作用，使得Cu的腐蝕速率降低。

3 結(jié)論

（1） 隨著磁場強度的增大，脂質(zhì)含量降低。無磁場時，生物膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物組成；磁場強度為28 mT條件下，生物膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物組成，但相比于無磁場條件下，蛋白質(zhì)含量降低，碳水化合物含量增多；磁場強度為60 mT條件下生物膜主要成分是蛋白質(zhì)和碳水化合物。

（2） 磁場加快Cu表面生物膜形成與剝落的速度，且磁場強度越大，Cu表面形成生物膜的速度越快。

（3） 與未施加磁場比較，純Cu在施加磁場條件下的Rct值顯著提高，腐蝕電位明顯負移，腐蝕電流密度減少，表明磁場可以抑制純Cu在混合海洋細菌環(huán)境中的腐蝕，且磁場強度為60 mT時比28 mT對Cu的腐蝕抑制作用更明顯。